乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在维持乙型肝炎病毒(HBV)的持续存在和促进乙肝病毒诱导的肝细胞肝癌维持干细胞特性(stemness)、侵袭和转移的分子机制中扮演着重要角色。  

GautamBuddha大学等研究机构的研究人员在2020美国肝病学会年会(AASLD2020)上发表了一项利用CRISPR/Cas9系统设计并合成了一种HBx基因特异性的小引导RNA(SgRNA),并在体外研究该小引导RNA(SgRNA)对HBV基因组整合肝癌细胞的HBx表达、HBsAg水平以及干细胞和上皮间质细胞转化(EMT)特性的影响的研究。  

AASLD2020:新型CRISPR/CAS9靶向HBx代表了一种有效的控制乙肝病毒诱导的肿瘤进展的非病毒治疗方法

研究人员首先在基于硅的工具上使用CRISPORweb设计出具有最小脱靶错配的针对HBx的sgRNA,然后通过克隆到非病毒eSpCas9-2A-Puro(PX459)V20载体(HBx-CRISPR)中进行开发。  

在体外,通过基于脂质的转染方法,用HBx-CRISPR或对照载体(PX459)转染HepG2-215(表达HBV的稳定肝癌细胞)。通过免疫荧光,集落形成,HBsAgELISA和实时PCR评估了新设计的HBx-CRISPR的效率和效果。  

研究人员使用设计的HBx-CRISPR切除了全长465bp的HBx基因,导致96小时后HepG2-2.15细胞中HBx基因表达的显著敲低(降低18倍,p<0.01图1A)。ELISA分析表明,经过96小时后,HBx-CRISPR处理使细胞上清液中的HBsAg水平降低了50%。  

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与用对照载体(p<0.05,图1B-C)和pGFP-HBx(p<0.01,图B-C)转染的细胞相比,用HBx-CRISPR处理的细胞还表现出形成的细胞集落数量显著减少。免疫荧光研究表明,与对照转染的细胞相比,在HBx-CRISPR处理的细胞中上皮蛋白CDH1(E-钙粘蛋白)的表达增强,而间充质蛋白VIM(波形蛋白)的表达降低(图D)。  

在基因表达研究中,与对照组和pGFP-HBx转染细胞相比,经HBx-CRISPR处理的细胞VIM基因显著降低(p<0.05,图E),而CDH1基因显著上调(p<0.01,图F)。  

综上研究表明,研究认为新型CRISPR/CAS9系统靶向HBx能有效降低HBV-HCC细胞的HBx基因表达、HBsAg水平以及细胞的干性和间质特性。这项研究代表了一种有效的控制乙肝病毒诱导的肿瘤进展的非病毒治疗方法。(更多肝病新药研究信息敬请关注“肝脏时间”微信公众号)!  

信息源:

TARGETINGHBxBYCRISPR/Cas9SYSTEMEFFECTIVELYREDUCESTHEEMTANDSTEMNESSCHARACTERISTICSOFHCCCELLSINVITRO.


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